精品论文

HPLC法水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的不确定度评定

 

彭家杰,李绪鹏,莫炯怀,邹潍力,卢伟华

(东莞市海洋与渔业环境监测站,广东 东莞 523002)

摘  要:依据JJF1059—1999《测量不确定度评定与表示》和CNAS-GL06《化学分析中不确定度的评估指南》规定的测量不确定度的基本方法,建立数学模型,分析了高效液相色谱法测定水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的不确定度来源,并对各分量进行量化,给出诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星测定结果的扩展不确定度。

关键词:HPLC;水产品;盐酸环丙沙星;诺氟沙星;恩诺沙星;不确定度

中图分类号:X832       文献标识码:A

 

氟喹诺酮类药物因其具有抗菌谱广、抗菌力强、低毒、组织穿透力强、结构简单、给药方便等优点[1],在国内外被广泛使用。由于在水产养殖中用其来预防和治疗细菌性疾病,易造成水产品中药物残留,增强了致病菌的耐药性,这种耐药性通过食品传递给人,使人产生难以治愈的疾病[2]。要确保水产品中不含氟喹诺酮类药物残留,这就需要检测方法具有较高的灵敏度和精确度,而检测方法的不确定度是判定测量结果准确度的依据。本实验依据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[3]和CNAS-GL06《化学分析中不确定度的评估指南》[4]规定的基本方法和程序,对HPLC法测定水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星和恩诺沙星残留量的不确定度进行分析评定,找出主要分量,从而提高检测质量。

1 材料与方法

1.1 标准品与试剂

诺氟沙星标准品纯度为99.5%±0.5%,盐酸环丙沙星标准品纯度为95.0%±1%,恩诺沙星标准品纯度为98.0%±1%,以上标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;正己烷和乙腈均为色谱纯,均购自Fisher scientific飞世尔实验器材(上海)有限公司;四丁基溴化铵,分析纯,购自上海凌峰化学试剂有限公司;盐酸,优级纯,购自广州化学试剂厂;超纯水(怡宝饮用纯净水),购自东莞市怡丰贸易有限公司;18.2MΏ·cm无水硫酸钠,购自汕头市西陇化工厂有限公司,(经650℃灼烧4h,置于干燥器内备用)为分析纯。实验用水为Milli-Q制备的超纯水。

1.2 仪器与设备

Waters2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司,配有2489 型紫外检测器),带二元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱及Waters Empower数据处理工作站;KS260basic振荡器(德国IKA公司);T25匀浆机(德国IKA公司);LXJ-IIB型离心机(上海安亭科学仪器厂);V700型多样品浓缩仪(瑞士BuChi公司);Milli-Q型超纯水仪(美国Millipore公司);BT125D型电子天平(赛多利斯公司)

1.3 样品前处理方法

参考农业部783号公告-2-2006《水产品中水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定 液相色谱法》进行。

2 结果与分析

2.1 数学模型

根据测量方法[5-7]建立样品中氟喹诺酮类药物的数学模型如下:

(1)

式(1)中,c为样品中氟喹诺酮类药物的含量(mg/kg);c为由标准曲线求得样品中氟喹诺酮类药物的浓度(mg/mL);V为样品稀释体积(mL) ;frep为重复性因子;m为样品称样量(g);R为方法回收率。

            (2)

2.2 相对不确定度分量的评定

2.2.1 由标准曲线求得样品中氟喹诺酮类药物的浓度引入的不确定度urel(c样) 样品中氟喹诺酮类药物浓度的不确定度包含标准溶液配制过程中的不确定度和校正曲线的不确定度。

2.2.1.1 标准溶液配制过程中相对标准不确定度 标准溶液配制过程中相对不确定度主要影响因素有:标准品相对不确定度;称量标准品所使用的天平引起的相对不确定度;配制标准使用液时所用1mL、2mL、5mLA级单标移液管引入的相对不确定度、、;配制标准使用液时所用10mL、100mLA级单标容量瓶引入的相对不确定度、。

2.2.1.2 标准溶液配制过程中相对不确定度urel(c)的数学模型为:

(3)

在诺氟沙星标准品证书上查得其纯度为99.5%±0.5%。在环丙沙星标准品证书上查得其纯度为95.0%±1%。在恩诺沙星标准品证书上查得其纯度为98.0%±1%。在95%的置信区间内,包含因子k=2。氟喹诺酮类药物纯度引入的相对不确定度,如表1所示:

表1 3种氟喹诺酮类药物纯度引入的相对不确定度

Table 1 The purity of 3 fluoroquinolones introduced relative uncertainty

药物名称 诺氟沙星 环丙沙星 恩诺沙星
2.51×10-3 5.26×10-3 5.10×10-3

称量标准品所用的天平,其仪器计量检定证书给出的扩展不确定度U=0.3mg,由于标准品的称量是二次称重过程,取矩形分布,,标准称样量为0.01002g。则称量标准品时天平引入的不确定度为:

根据JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》[8]要求,1mLA级单标移液管允许的误差为±0.007mL,2mLA级单标移液管允许的误差为±0.010mL,5mLA级单标移液管允许的误差为±0.015mL,10mLA级单标容量瓶允许误差为±0.020mL,100mLA级单标容量瓶允许误差为±0.100mL。以上各量按均匀分布,,则各量的相对不确定度为:

将以上各项不确定度分量代入公式(3),结果如表2所示:

表2 3种氟喹诺酮类药物标准溶液配制引入的相对不确定度

Table 2 3 fluoroquinolones in the preparation of standard solution into the relative uncertainty

药物名称 诺氟沙星 环丙沙星 恩诺沙星
1.83×10-2 1.89×10-2 1.88×10-2

2.2.1.3 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度。

表3 3种氟喹诺酮类药物的标准曲线测定结果和不确定度计算

Table 3 Standard curves of three fluoroquinolones and uncertainties

药物

名称

质量浓度C

/(μg/mL)

峰面积A/

(mAU·s)

线性回归方程

A=a+bC

相关

系数r

C0/

(μg/mL)

/

(μg/mL)

S
诺 氟

沙 星

0.001 212068 y = 308534552.4111x + 140704.7744 0.9998 0.00277 0.0272 455866.78 1.01×10-3
0.005 1569652
0.010 3260744
0.020 6700914
0.100 30920845
盐酸

环丙

沙星

0.001 125034 y = 208404512.8318x – 56324.9490 0.9998 0.00072 0.0272 140498.28 7.69×10-4
0.005 885515
0.010 1975298
0.020 4323176
0.100 20752366
恩 诺

沙 星

0.001 290688 y = 530262169.3326x – 157134.6058 0.9999 0.00186 0.0272 309593.21 6.64×10-4
0.005 2253464
0.010 5079844
0.020 10909822
0.100 52796164

对3个混合标准系列工作液进行测量,每个浓度点测量1次,将峰面积平均值(A)与相应标准溶液质量浓度(C)采用最小二乘法拟合标准曲线,检测结果及线性回归方程见表3。标准曲线引入的相对标准不确定度,其中s为回归直线标准偏差:;式中,Ai为第i个质量浓度点测定的响应值(峰面积值);(a+bCi)为按回归方程计算得出的第i点的响应值,a为线性回归方程的截距,b为斜率;n为标准溶液浓度点,n=5;Ci为第i点的质量浓度值,C0为样品的测定值(测定次数p=1),为标样质量浓度的平均值,结果如表3所示。

由于不确定度包含标准曲线配置过程中的不确定度和标准曲线拟合引入的相对标准不确定度。因此,由标准曲线求得样液中3种氟喹诺酮类药物的浓度引入的相对不确定度为:,结果见表4。

表4  样品中氟喹诺酮类药物浓度的不确定度

Table 4 Uncertainty in a sample of 3 fluoroquinolones concentration

药物名称 诺氟沙星 环丙沙星 恩诺沙星
1.83×10-2 1.89×10-2 1.88×10-2

加标回收率引入的相对标准不确定度

样品前处理过程复杂,需经过均质、提取、浓缩等步骤,难以对各环节进行逐一评定,可通过加标回收率对制样过程进行不确定度评定。对空白鱼样添加0.02 mg/kg水平的混合标准,进行6次加标回收试验,加标回收率结果见表5。根据回收率平均值的标准差计算的标准不确定度,用t检验法()来检验回收率是否与100%存在显著差异。查t值表得,则平均回收率与100%存在显著差异。需由公式对回收率的不确定度进行修正。式中k为包含因子,这种差异如果按均匀分布,。计算结果见表5。

表5 3种氟喹诺酮类药物的加标回收率测定结果和不确定度计算

Table 5 Recoveries of three fluoroquinolones at different spike levels and uncertainties

项    目 药物名称
诺氟沙星 盐酸环丙沙星 恩诺沙星
回收率/%

(n=6)

加标水平

/(mg/kg)

0.02 89.2 89.5 95.8
88.6 88.65

98.7

 

91.5
97.8 98.7 95.3
90.1 91.4 99.6
93.1 93.6 90.1
101.7 101.0 90.0
93.417 93.808 93.717
5.290 5.033 3.828
2.160 2.055 1.563
4.37×10-2 4.12×10-2 3.95×10-2
t 3.048 3.013 4.020
P 显著 显著 显著

样品前处理过程复杂,需经过均质、提取、浓缩等步骤,难以对各环节进行逐一评定,可通过加标回收率对制样过程进行不确定度评定。对空白鱼样添加0.02mg/kg水平的混合标准,进行6次加标回收试验,加标回收率结果见表5。根据回收率平均值的标准差计算的标准不确定度,用t检验法()来检验回收率是否与100%存在显著差异。查t值表得,则平均回收率与100%存在显著差异。需由公式对回收率的不确定度进行修正。式中k为包含因子,这种差异如果按均匀分布,。计算结果见表5。

2.2.2 样品处理的相对标准不确定度 样品处理引入的相对不确定度主要为称量样品所使用的天平引入的相对标准不确定度和样品浓缩后用1.0mL流动相定容引入的相对标准不确定度。

称量样品所用天平其仪器计量检定证书给出的扩展不确定度U=0.3mg,由于称量是二次称重过程,取矩形分布,。样品称样量为5g(精确到0.0001g),称量样品所用天平引入的相对不确定度为:

参考JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》可知,A级1.0mL单标线吸量管最大允差为±0.007mL,按均匀分布,吸量管检定的相对标准不确定度为:

2.2.3 测量重复性引入的相对标准不确定度 对同一空白鱼样加标样品进行前处理和色谱测定,重复6次,用贝塞尔公式计算不确定度,评定结果见表6。

表6 重复测定结果和不确定度计算

Table 6 Results of repeatability and uncertainties

药 物

名 称

(mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)
1 2 3 4 5 6
诺 氟

沙 星

0.01784 0.01772 0.01956 0.01802 0.01862 0.02034 0.01868 1.058×10-3 4.319×10-4 2.31×10-2
盐酸环

丙沙星

0.01790 0.01773 0.01974 0.01828 0.01872 0.02020 0.01876 1.007×10-3 4.111×10-4 2.19×10-2
恩 诺

沙 星

0.01916 0.01830 0.01906 0.01992 0.01802 0.01800 0.01874 7.656×10-4 3.126×10-4 1.67×10-2

2.3 合成不确定度及检测结果表述

以上各不确定度分量相互独立,不考虑分量间的相关性,把上述各值代入公式(2)中,最终检测结果取包含因子,用扩展不确定度表示,见表7。

表7 不确定度评定结果

Table 7 Uncertainty evaluation for the determination of three fluoroquinolones

药 物

名 称

U 检测结果
(mg/kg)
诺 氟

沙 星

1.83×10-2 4.05×10-3 4.37×10-2 2.31×10-2 8.66×10-5 5.29×10-2 9.87×10-4 1.97×10-3 0.01868±0.00197
盐酸环

丙沙星

1.89×10-2 4.05×10-3 4.12×10-2 2.19×10-2 8.66×10-5 5.05×10-2 9.47×10-4 1.89×10-3 0.01876±0.00189
恩 诺

沙 星

1.88×10-2 4.05×10-3 3.95×10-2 1.67×10-2 8.66×10-5 4.70×10-2 8.81×10-4 1.76×10-3 0.01874±0.00176

 

3 结论

本文通过对HPLC法测定水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留量的不确定度各分量的评定,可知其最终结果的不确定度主要由标准曲线拟合、样品前处理过程和测量重复性带来的不确定度占有较大的比重,这与魏博娟[9]得出的由于加标回收带来的不确定度分量对总不确定度影响较大的结论具有相似性。此外,为标准溶液配制中技术人员操作带来的不确定度。因此,为保证最终检测结果的可靠性,降低不确定度,在实际操作过程中可通过增加混合标准系列工作液测定次数、优化样品前处理方法、增加平行样的测定及选择精度较高的玻璃量器。但是,本试验只考虑了检测环节中对检测结果有影响的各不确定度分量,其样品采集和制备过程中对检测结果带来的不确定度影响也不能忽略。

参考文献

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[8] 国家质量监督检验检疫总局.JJG 196-2006常用玻璃量器检定规程[S].北京:中国计量出版社,2006.

[9] 魏博娟,吴成业,钱卓真,等.液质联用法测定水产品中喹诺酮类药物残留量的不确定度评定[J].南方水产科学,2012,8(3):59-64.

基金项目:东莞市科技计划资助项目(K10017K)

作者简介:彭家杰(1984-),男,助理工程师,研究方向:海洋与渔业环境监测。卢伟华(1966-),男,高级工程师,研究方向:海洋与渔业环境监测,水产品质量安全监控。

 

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本文已公开发表在《农业与技术》杂志2014年第06期